β-каротен в добавки и суровини
Високоефективна течна хроматография с обърната фаза
Този метод е приложим за определянето на всички транс- и общият β-каротен в добавки и суровини от 0 до 200 mg/g освен порести материали или таблетки направени от порест материал.
В таблици 2005.07А –D са представени резултати от 11 лаборатоирии занимаващи се с изследване на β-каротен , изпозвайки този метод.
1. Принцип на метода
Водно дисперсните формирования като емулсии, прохообразни вещества, капсули и таблетки се подлагат на действието на протеази и се екстрахират с дихлорметан и алкохол. Масните сусрензии се разтварят директно в дихлорметан и алкохол. Екстрактът се хроматографира на HPLC система с колона С18, при изократъчен режим на работа, при което става разделяне на преобладаващите геометрични изомери на β-каротена от другите изомери и от останалите каротеноиди като всички транс-α-каротен, ликопен, криптоксантин, лутеин и зеаксантин. В случай че продуктите са с относително високо съдържание на α-каротен, а цис-изомерите на α-каротена пречат на определянето на β-каротена, екстрактът по-нататък трябвада се хроматографира на по-селективна колона С30 при обърната фаза на HPLC система с градиентен режим на работа, така че да се намали преченето при определянето.
2. Реактиви
а) β-каротен тип II – Sigma-Aldrich (St.Lous, MO; USA; CAS 7235-40-7).Чистота >95%,
б) Алкална протеиназа R. – Bio-Cat ,Inc. ( Troy, USA)
в) n-хексан
г) Циклохексан
д) Тетрахидрофуран
е) Етанол
ж) Дихлорметан
з) Протеаза – бактериална алкална протеаза приготвена във вода; субтилизин
и) Метанол
й) Бутил-хидротолуен (BHT)
к) N-етилендиизопропиламин
л) 2-пропанол
м) Амониев ацетат
н) Ацетонитрил
о) Метил- терт-бутил етер (MTBE)
п) Вода – дестилирана или деминерализирана
р) Контролни разтвори за течна хроматография
1) Подготовка
Разтварят се около 3 mg β-каротен вещество еталон и 1 g BHT в 50 ml тетрахидрофуран. Прибавя се 200 ml етанол и се оставят за 2 часа на водна баня при 80 ºC. Охлажда се, долива се до 500 ml с етанол и разтвора се прехвърля в епруветка с винт. Хомогенизира се добре, оставя се да престои едно денонощие при стайна температура и разтворът се разлива в голям брой виалки (малки стъклени шивенца) за течна хроматография. Виалките внимателно се запечатват веднага след поставянето на тефлон/силиконова преграда и се съхраняват при 5ºC на тъмно.
2) Приложение на контролните разтвори за течна хроматография
Измерване на началното съдържание на β-каротен в контролния разтвор, когато системата за течна хроматография се калибрира. Инжектира се паралелно със стандартния разтвор, поне шесткрано 20μl в HPLC състемата. Изчислява се средното съдържание на β-каротен в контролния разтвор получени от хроматограмата,чрез използване на определимия фактор на отговор. След това се инжектира контролния разтвор заедно със всяка серия от тестваните екстракти. Коефициентът на отговор се приема за константа докато измеваното количество на β-каротен в контролния разтвор отговаря на началнота стойност с +/- 2%.
с) Подвижната фаза А за HPLC системата
В една еднолитрова колба се разтваря 50 mg BHT в 20 ml 2-пропанол и се добавя 0.2 ml
N-етилендиизопропиламин, 25 ml 0,2% разтвор на амониев ацетат, 445 ml ацетонитрил и
450 ml метанол. Сместа се охлажда и свие. Затопля се при стайна температура и се долива до марката с метанол.
т) Подвижната фаза Б за HPLC системата
Разтвор 1
В еднолитрова мерителна колба се разтваря 200 mg витамин С в 500 ml метанол, добавя се 100 ml MTBE и се долива до мярката с метанол. Изхвърля се след престои от 2 дни.
Разтвор 2 – MTBE
3.Апаратура
а) Аналитична везна мереща с точност до 0.0005 g.
б) Спектрофотометър- Двойнолъчев, обхват от 190-900 nm, точност на дълвината на вълната 0.07 nm (при 541.92 nm).
в) Ултразвукова вана 150 W, 35 kHz, 4 L.
г) Ротацьионен вакуум изпарител – 5-200 об/мин, 20º - 100ºC свързано с вакуум помпа, абсолютно мин. налягане от 10 mbar.
д) Хомогенизатор – 750 W, 12 mm диаметър на деспергиращия агрегат.
е) Спринцивка –за еднократна употреба от 2 μl.
ж) Филтър за еднократна употреба , 0.45 μm размер на порите, 25 mm диаметър,за органични разтворители.
з) Течен хроматограф – състои се от помпа, колонен термостат, oбезгазяващо средство, автосемплер, UV-Vis детектор , интегратор.
1.Управление на условията за система А
Колона, Suplex pKb-100, Supelco, 5 μm, 250 x 4.6 mm, температура на колоната 30ºC, температура на автосемплера 15 ºC, подвижна фаза – от Б точка с), скорост на потока 0.6 ml/min; налягане 33 bar; обем на инжект
Целият материал:
анализ на каротен.rar- (18.96 KiB) Свалено 20 пъти